大鼠Ⅱ型膠原α1(COL2a1)檢測試劑盒
簡介
Ⅱ型膠原α1(COL2a1)是一個 II 型膠原蛋白的α-1 鏈，II 型膠原蛋白是一種纖維狀的膠原蛋白，存在于軟骨和眼睛的玻璃體中，該基因的突變與軟骨發(fā)育 不全、早發(fā)性家族性骨關(guān)節(jié)炎、先天性 SED、Langer-Saldino 軟骨發(fā)育不全、Kniest發(fā)育不全、Stickler 綜合征I型和Strudwick 型脊柱骨骺線發(fā)育不全 有關(guān)，加工軟骨素的缺陷也與軟骨發(fā)育不良有關(guān)，軟骨素是一種鈣結(jié)合蛋白，是這種膠原分子的C肽，II 型膠原蛋白可增加結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)和強度，主要存在于軟骨、填充眼球的果凍狀物質(zhì)（玻璃體）、內(nèi)耳以及脊柱中椎體之間的椎間盤中心部分（髓核），三個 pro-alpha1(II)鏈纏繞在一起，形成一個三股的、像繩索的procollagen 分子，這些原膠原蛋白分子必須由細胞內(nèi)的酶來處理，一旦這些分子被處理，它們就會離開細胞并排列成長而 細的纖維狀，在細胞周圍的空間中相互交聯(lián)，交聯(lián)的結(jié)果是形成非常強大的成熟II型膠原蛋白纖維。

檢測原理

試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物COL2a1，清洗后，再加入標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中COL2a1的濃度。

操作要點

1. 混合蛋白質(zhì)溶液時，應始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。此外，每種試劑應單獨使用容器。

2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

3. 當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。

4. 顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應從無色變?yōu)樗{色。

5. 應按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
注意事項

1. 本試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護手套、眼睛和面部防護用品，處理后洗手。

試劑準備

1. 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

2. 洗滌液/稀釋液配置：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
大鼠Ⅱ型膠原α1(COL2a1)檢測試劑盒
標準品配置

試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從60ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至3000pg/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的3000pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將3000pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為:  3000pg/mL、 1500pg/mL、 750pg/mL、 375pg/mL、 187.5pg/mL、 93.75pg/mL、 46.88pg/mL，從濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)。

結(jié)果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。

本圖所示標準曲線僅供示例，結(jié)果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結(jié)果
靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為23.44pg/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別天然和重組大鼠COL2a1。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。

實驗步驟匯總
1. 加標準品及樣品，37℃避光反應1.5h，洗滌3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應1h，洗滌4次。

3. 加酶結(jié)合物，37℃避光反應30分鐘，洗滌4次。

4. 加顯色液，37℃避光反應15分鐘。

5. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

大鼠Ⅱ型膠原α1 ELISA檢測試劑盒用于定量檢測細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中大鼠的COL2a1、使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書，大鼠ELISA試劑盒僅供科研使用，不能于其它診斷。